合作文章丨Biomoleculars：中大五院揭示胰腺癌低氧脂質代謝相關基因的分子分型
發布時間：
2023-07-28 15:40:18
來自中山大學附屬第五醫院腫瘤中心的曾林涓團隊通過使用基于超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS）技術的非靶向代謝組學等研究手段，結合生物信息學方法分析，探討了低氧微環境下PDAC脂質代謝的表達模式，根據HIF-1途徑和參與鞘脂過程的基因確定了有助于制定針對胰腺導管腺癌患者代謝特征的潛在個性化治療方案以及脂質代謝和缺氧相關的預后亞型。相關成果發表在期刊Biomoleculars（IF：6.06）上。唯譽智合科技（Verygenome Technology ）為本研究提供了轉錄組、脂質組和代謝組學檢測的技術支
脂質代謝異常通常發生在缺氧微環境下，是癌細胞增殖和轉移的重要能量補充途徑。為了確定可用于PDAC（pancreatic ductal adenocarcinoma，胰腺導管腺癌）預后和治療的分子分型的生物標志物，探索與缺氧相關的胰管腺癌的脂質代謝特征和基因表達特征，來自中山大學附屬第五醫院腫瘤中心的曾林涓團隊通過使用基于超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS）技術的非靶向代謝組學等研究手段，結合生物信息學方法分析，探討了低氧微環境下PDAC脂質代謝的表達模式，根據HIF-1途徑和參與鞘脂過程的基因確定了有助于制定針對胰腺導管腺癌患者代謝特征的潛在個性化治療方案以及脂質代謝和缺氧相關的預后亞型。相關成果發表在期刊Biomoleculars（IF：6.06）上。唯譽智合科技（Verygenome Technology ）為本研究提供了轉錄組、脂質組和代謝組學檢測的技術支持。
以下為本文研究方法介紹。
PDAC中氧化水平變化和脂質降解代謝途徑變化的鑒定
為了鑒定基因表達的變化，作者分別篩選了GSE28735和GSE62452中的差異表達基因（DEG），以及正常組織和PDAC組織對，DEG比對的結果以火山圖顯示。在兩個數據集之間，302個DEG發生重疊。使用GO功能富集和KEGG途徑分析進一步檢查生物學功能，多個GO富集結果表明DEG與缺氧和脂質代謝有關；此外，KEGG通路分析表明，相關途徑包括脂肪消化和吸收和脂質代謝。結合以上結果可知，PDAC表現出組織氧化水平變化和脂質代謝方面的一些變化，主要是降解代謝途徑方面。
基于LC-MS的代謝組學分析及常氧和低氧培養的代謝組學差異分析
為了進一步了解細胞水平上代謝物的變化，作者選擇了兩種類型的PDAC細胞系進行了研究。首先，使用CoCl2在兩種細胞系PANC-1和CFPAC-1中分別構建了體外缺氧模型，然后通過增加HIF-1α蛋白的表達來證實缺氧的充分誘導。
作者分別使用LC-MS（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，液相色譜-質譜聯用儀）對正?；蚰M缺氧條件下培養細胞的樣品進行代謝組學分析。共鑒定出266種代謝物，其中164種代謝物被鑒定為富集代謝物，102種未被富集。熱圖表明，在兩種細胞系中，許多代謝物都發生了強烈的變化。缺氧時，代謝物如磷脂酰膽堿和磷酸乙醇胺同時升高，它們可能干擾甘油磷脂代謝；而高強度增殖的癌細胞需要大量的甘油磷脂用于膜的生產。在兩種類型的細胞系中，參與組氨酸代謝的物質在缺氧條件下均被下調。組氨酸的攝入和代謝顯示會影響癌細胞對甲氨蝶呤的敏感性。單磷酸腺苷、L-肉堿、甘油磷酸膽堿和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-PC等代謝物發生了變化，導致SMPDB中極長鏈脂肪酸的β氧化和支鏈脂肪酸氧化等脂質代謝效應受到抑制。
聚焦于HIF-1α的轉錄組學數據分析
為了獲得更精確和更深入的分析結果，作者從TCGA下載了PDAC患者的數據集。HIF-1α被認為是缺氧環境的核心。對以上數據進行分析，可知186例患者中共有5874個基因與HIF-1α存在統計學意義（qvalue<0.05）和正相關（Spearman系數>0）關系。排名前20位的基因如下圖a所示。通過KEGG數據庫對上述基因進行進一步富集途徑分析，最終富集得到122條KEGG途徑。結果表明，金黃色葡萄球菌感染獲得了較高的富集分數。而根據之前的研究，在缺氧條件下，中性粒細胞殺死細菌的能力可能受損。這一結果可能解釋了為什么金黃色葡萄球菌感染受到顯著影響，并被認為是癌癥患者發病率和死亡率的重要原因；癌癥發展過程中細胞粘附的關鍵步驟之一似乎也與HIF-1α的變化有關。
此外，還有一些與脂質相關的途徑，如鞘脂在癌癥的細胞死亡、存活和治療抵抗中發揮重要作用。作者通過使用Kaplan–Meier生存分析結合正相關基因結果的批量篩選，顯示了TCGA數據集中與PDAC患者OS有顯著關聯的504個基因，發現這些基因蛋白表達相對較高和較低的患者的存活時間有差異。以上均為導致PDAC患者生存率低的因素。作者通過GEPIA2分析PDAC中基因的mRNA表達水平，發現252個基因具有顯著性。使用多個篩選基因，KEGG中鞘脂信號通路顯示出顯著的差異富集，重疊基因為GNAI3、KRAS、NRAS、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E。該代謝途徑中交叉基因的mRNA表達水平和Kaplan-Meier生存分析（GNAI3、KRAS、NRAS、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E）如圖S1c、d所示。由于KRAS和NRAS突變被認為是PDAC的內在特征，作者又檢測了兩個PDAC系中其他四個基因的mRNA水平，發現低氧培養顯著增加了參與鞘磷脂信號通路過程的GNAI3、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E的表達。以上結果可顯示其中的關聯性。
HIF-1和鞘脂基因鑒定的PDAC亞型
作者整合了來自多個PDAC數據集的RNA序列數據，包括TCGA PAAD、GSE71729、ICGC PACA-CA和PACA-AU。排除非PDAC樣本和無臨床信息特征的樣本后，共有563名患者留在最終的樣本中。作者選取了屬于KEGG基因集HIF-1信號通路（hsa04066）的基因（n=109），GO基因集SPHINGOLIPID METABLIC PROCESS（GO:0006665）（n=162）用于無監督聚類分析。該方法結合了來自不同實驗的數據，提高了所有數據集的共同特征的可信度，并揭示了其中的重要特征。作者通過相應的累積分布函數（CDF）曲線和三角面積圖（K=3），對合并的數據集應用無監督聚類法，將PDAC聚類為三個子類型（如下圖a）。合并數據中聚類1、2、3的病例的占比分別為10.48%、32.5%、57.02%。主成分分析（PCA）（如下圖b）表明，各組可以成功地根據特征亞型分類對樣本進行區分和分類。此外，作者還調查了三個類型的預后。生存曲線表明，類型1中的樣本的生存時間總是較短，以天為單位，而類型2預測的生存時間最長?？傮w而言，與類型1相似的類型3的生存結果較差（如下圖c）。結果表明，PDAC中存在低氧脂質代謝亞型，并伴有不同的預后情況。
突變特征的分布及與其他PDAC亞型的關聯
代謝亞組中HIF-1和鞘脂基因的表達水平的熱圖表明，集群中mRNA表達之間存在細微差異。此外，作者分析了不同組間參與HIF-1信號通路的基因的變化。與類型2相比，類型3的相關基因變化更多（如下圖a）；BCL-2蛋白可以控制細胞死亡，并在類型3中發生顯著變化；RELA作為低氧反應的關鍵轉錄因子，在類型1和類型3中，與類型2相比有所增加；ELOVL1、SMPD3和DEGS1參與鞘脂代謝過程，并實現類型1和3中的升高。
基因表達分析顯示，類型3中HIF1α相關基因P4HA1的表達增加，類型1中鞘脂信號基因SPHK1和SPHK2的表達增加。為了尋找與集群中mRNA表達相關的被影響途徑，作者進行了綜合分析，包括差異表達分析和功能富集。篩選的基因顯示了功能的顯著差異?？梢娤卤?。
在體細胞變化中，最常見的驅動基因（KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4）仍處于最高位。類型2中MUC16突變的變異明顯高于類型1和類型3亞組（如下圖b）。先前的研究表明，MUC16基因的突變數與TMB（tumor mutational burden，腫瘤突變負荷）密切相關，而MUC16高突變數與更好的OS（overall survival，總體生存率）相關。在先前的研究中，存在與生存率相關的PDAC基因表達亞型，如basal-like型和squamous型的預后較差。作者為了研究上述的分類和以前的類型之間的關系，于是將樣本分為不同的亞型，并分析每個類型的組成（如下圖c）。結果較差的1組和3組分別包括basal-like型病例（59.32%；82.86%）和squamous型病例（38.98%；34.57%）。存活時間較長的類型2大部分為經典樣本（63.93%），而basal-like型（36.1%）和squamous型（4.37%）樣本較少。結果表明，與低氧脂質代謝相關的途徑可以幫助我們識別具有不同預后的PDAC亞型。
總結
作者通過對不同表達基因的富集分析，發現PDAC中存在異常的脂質代謝和氧變化。兩種PDAC細胞的非靶向代謝組學分析清晰地指向HIF-1α蛋白相關代謝物；通過確定可能在缺氧環境中受到干擾的代謝物，分析了可能受到影響的許多脂質代謝途徑；通過多重分析，完成了在TCGA PDAC數據中，與HIF-1α呈正相關的基因鑒定；使用篩選出的基因補充了鞘脂信號通路；根據HIF-1途徑和鞘脂過程的基因，確定了三個亞型（類型），并發現亞型與患者不同的存活率相關，第2組患者比其他組患者有顯著的生存優勢。
原文鏈接：https://www.mdpi.com/2218-273X/12/10/1533
相關新聞
